一、基本原理

高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。

高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 

高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。   

二、高效液相色谱分析原理

（1） 高效液相色谱分析的流程：

由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 

（2） 高效液相色谱的分离过程：

同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

三、工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

四、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压——压力可达150–300 kg/cm²。色谱柱每米降压为75 kg/cm²以上。

高速——流速为0.1–10.0 mL/min。 

高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快——通常分析一个样品在15–30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。    

样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

五、液相色谱的五大系统

1、进样系统

进样系统分为手动进样阀和自动进样器。

手动进样阀

对于手动进样阀，使用过程中需要注意每个样品进样完成后应对进样阀进行清洗，防止残留对下一个样品分析的影响。

还需要注意进样方式，以20μL定量环为例，我们可以选择完全充满定量管或部分充满定量管。为了保证进样的重复性，选择完全充满定量管进样方式时，需要注入定量环体积3倍以上的样品;选择部分充满定量管进样方式时，进样体积应在定量管体积一半以下，即1–10μL。

自动进样器

如果采用自动进样器进样，首先需要保证注射器里面没有气泡存在，否则影响进样量准确性;其次是样品瓶里面有足够的样品，保证进样针能够吸到样品。

为了避免交叉污染需要定期对样品瓶、盖和垫进行清洗。若自动进样器长时间不使用，应该注意：腐蚀性的流动相或洗液(例如，碱性或酸性缓冲溶液)必须完全从系统中置换出来。同时，为了避免细菌的生长，应将一个样品瓶中充满甲醇，并重复几次进样操作。

2、输液系统

输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。

输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1–10mL/min）；

b 能抗溶剂腐蚀；

c 有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150–300×105Pa。

（1）往复式柱塞泵结构和原理

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。

这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

（2）气动放大泵结构和原理

其工作原理是：压力为p1的低压气体推动大面积（SA ）活塞A，则在小面积（SB ）活塞B输出压力增大至p2的液体。压力增大的倍数取决于A和B两活塞的面积比，如果A与B的面积之比为50：1 ，则压力为5×105Pa的气体就可得到压力为250×105Pa的输出液体。这是一种恒压泵。

泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆。单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成。在压力的作用下宝石球离开阀座，流动相流过单向阀；反之，在反向力的作用下，宝石球回到阀座上，此时流动相不再流过单向阀。

显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏。为了保证单向阀不发生泄漏，一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座，也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上。

在不同的应用领域，单向阀阀体的材料有所不同，例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛，而不用不锈钢。为了降低成本和减少维护费用，一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件，当然其功能仍保持不变。

输液系统即是指高压恒流泵，其作用是能提供稳定准确的流速。

溶剂过滤头：吸液过滤头，或称沉子，主要作用是过滤流动相中可能存在的颗粒性杂质。长时间使用后，杂质有可能阻塞溶剂过滤头上的过滤板孔隙；或长时间使用缓冲液，过滤头表面容易产生一层膜，阻碍流动相正常通过。

严重时，即使是已超声过的溶剂，泵吸液时也会有气泡在四氟输液管里产生，因此应经常对过滤头进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系统需注意滤头的烘干处理。

单向阀：单向阀的作用是确保液体向一个方向流动，是高压恒流泵稳定输液的保证。日常使用过程中，可以通过观察压力的情况，初步判断流量是否正常。

如果系统已经平衡一段时间，压力应该是稳定的。但如果压力存在波动，则表明流量不稳定；如果无压力，则表明无流量。这两种情况大多是因为单向阀里混入了气泡或杂质。

混入气泡的情况，应把放空阀打开，按冲洗键将里面的气泡排出。单向阀混入杂质的情况，须对其进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇，安装时注意标记环的方向。

密封圈：密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔内的液体泄漏，是保证泵头输液正常的关键部件。但柱塞杆和柱塞密封圈长期使用会发生磨损，主要与流量、操作压力和所使用的流动相有关。

当使用含盐的流动相时，由于脱水或蒸发，可能形成盐结晶，而泵运动时盐结晶会导致密封圈和柱塞杆的磨损。因此，每天实验前和实验后都需用纯水冲洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二级密封圈之间)，保持清洗管内有水以防止形成晶体，延长柱塞杆和密封圈的使用寿命。

在线过滤器：为了防止由于流动相杂质微粒进入色谱系统，泵在放空阀内安装了在线过滤器，经泵出口流出的液体通过在线过滤器，经排空管流出的液体不通过在线过滤器。

仪器使用一定时间后，建议用户清洗在线过滤器的烧结不锈钢过滤片。用扳手卸下压帽，将密封环和烧结不锈钢过滤片一同取出清洗，清洗后按原位装上。清洗溶剂可以选择30%稀硝酸溶液，正相系统需注意滤头的烘干处理。

3、分离系统
分离系统包括色谱柱、保护柱以及柱温箱。色谱柱：色谱柱是样品分离的核心。色谱柱在使用前必须仔细阅读说明书，了解色谱柱使用的pH值范围、溶剂耐受范围、压力范围和维护方法等事项。色谱柱使用完后，需及时对色谱柱进行冲洗。冲洗完成后，应该将色谱柱从仪器上拆下来，两端用厂家配的堵头密封后，保存在色谱柱盒里。
保护柱：保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质对色谱柱污染，从而延长色谱柱的寿命。针对不同型号的色谱柱，应选择相对应填料的保护柱。应注意柱芯也是有寿命的，应该定期进行更换。
柱温箱：色谱柱温度变化，可能会导致保留时间的变化。为了避免这个问题，建议使用柱温箱。

4、检测系统
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点是，使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、灵敏度高（检测下限为10^-10 g/mL）、线性范围宽、对温度和流速变化不敏感、可检测梯度溶液洗脱的样品。
（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10^-7 g/mL），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。
（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g/mL），痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用。
HPLC常用的检测器是紫外检测器。在日常使用过程中紫外检测器主要需要注意检测池和氘灯的使用与维护。
检测池：检测池长时间使用可能会造成污染，如果仪器的参比能量(REF ENERGY)正常，测量能量(SMPENERGY)偏低，可能为检测池污染导致，可以对检测池进行清洗。
对检测池零件的进行清洗，一般先采用约1:4的硝酸溶液超声清洗，分别用纯水和甲醇溶液清洗，然后重新组装并将检测池池体推进池腔内，拧紧池板螺丝。注意组装中，池玻璃及垫片一定要放正，以免压碎池玻璃，造成检测池泄漏。
氘灯：氘灯正常使用寿命可在1500小时以上。灯的使用寿命与检测器的使用时间和开启频率有关，因此使用过程中应尽量节省不必要的开机时间，减少开关频率，以延长氘灯的使用寿命。
如果准确地判断出氘灯已经不能点亮或能量太低，则需要更换新的氘灯。在购买氘灯时，应注意咨询和核对氘灯的型号与仪器型号是否匹配。更换到氘灯时，参照仪器说明书中的相关内容，特别要注意氘灯连接线的位置顺序。

5、数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

六、色谱法的常用基本术语

1、色谱图（chromatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、（色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。4、峰高（h, peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1 中的BE）。5、峰宽（W, peak width）：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点的距离。6、半高峰宽（W_h/2, peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。7、峰面积（A, peak area）：峰与峰底之间的面积。8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。13、原点（origin）：纸或薄层板上滴加试样部位的中心点。14、斑点（spot）：平面色谱法中，组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区（图2）。15、区带（zone）：在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。16、复斑（multiple spot）：一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。17、区带拖尾（zone tailing）：由于物理、化学等作用的影响，一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。18、基线（base line）：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。19、基线漂移（baseline drift）：基线随时间定向的缓慢变化。20、基线噪声（N, baseline noise）：由于各种原因而引起的基线波动。

七、应用领域

环境：常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、 农药、酸沉降成分。 农业：土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。石油：烃类族组成、石油中微量成分。 化工：无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。材料：液晶材料、合成高分子材料。 食品：无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃。 生物：氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。医药：人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。

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